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Evaluación de la viabilidad celular de la pulpa dental frente a la aplicación de pastas antibióticas con ciprofloxacino y metronidazol


Evaluación de la viabilidad celular de la pulpa dental frente a la aplicación de pastas antibióticas con ciprofloxacino y metronidazol

C. D. Verónica Stephanía Muñoz Guevara. Alumna de la especialidad de Odontopediatraía, FO UNAM.

Mtro. César Darío González Núñez. Profesor de la especialidad de Odontopediatría, FO UNAM.

Dr. Marco Antonio Álvarez Pérez. Profesor responsable del Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos, FO UNAM.

Resumen


La caries dental en la dentición temporal, es un problema de salud pública a nivel mundial. Cuando afecta a la pulpa dental, se deben realizar procedimientos operatorios que permitan devolver la función masticatoria del paciente pediátrico. Anteriormente, el material más utilizado para la terapéutica pulpar (pulpotomía), era el formocresol, sin embargo, en los últimos años se ha hablado de un posible potencial cancerígeno. Por esto, que se han desarrollado nuevos materiales, para evitar los posibles efectos adversos del formocresol. Objetivo: Evaluar la viabilidad de las células de la pulpa dental frente a la aplicación de diferentes concentraciones antibióticas (ciprofloxacino y metronidazol). Materiales y métodos: Se realizó la colecta de tejido pulpar a partir de dientes supernumerarios extraídos a pacientes pediátricos, una vez proliferadas las células pulpares se evaluó su viabilidad frente a la aplicación de ciprofloxacino, metronidazol y ciprofloxacino/metronidazol a los 3, 6, 9, 12 y 15 días mediante ensayos colorimétricos con CCk-8. Resultados: Los resultados de la prueba Kruskal Wallis mostraron que en el día 3 el valor de P fue de 0.046. En el día 6 se obtuvo un valor de 0.009, en el día 9 resultó de 0.020. En el día 12 fue de 0.030. Y en el día 15 de 0.382 Conclusión: Existe viabilidad de las células de la pulpa dental en presencia de antibióticos. Las concentraciones de los mismos son un factor importante a considerar para permitir que el crecimiento celular sea adecuado.

Palabras Clave: viabilidad celular, pulpotomía, ciprofloxacino, metronidazol.


La caries dental, es la enfermedad bucodental más común de la infancia. La prevalencia es alta, aproximadamente del 50% al 60%. Si no se trata, la progresión de la caries puede aproximarse a la pulpa, poniendo en peligro la vitalidad del diente, causando infección y pérdida prematura.1,2

Cuando la caries afecta a la pulpa, como una “Pulpitis Reversible”, la pulpotomía es el tratamiento de elección. Esta es la amputación del tejido pulpar infectado coronalmente para mantener la vitalidad y la función de la pulpa radicular. El procedimiento se basa en la justificación de que el tejido de la pulpa radicular está sano o es capaz de cicatrizar después de la amputación de la pulpa coronal afectada.3,11

Existen varias técnicas con diferentes protocolos. Los enfoques farmacoterapéuticos implican revestir el tejido pulpar con formocresol, gultaraldehído, sulfato férrico, hidróxido de calcio, MTA, NaOCl, etc.4

El formocresol, se considera como el agente de pulpotomía Estándar de Oro, debido a sus propiedades bacteriostáticas y fijadoras, es el más frecuentemente utilizado con una gran tasa de éxito.5 Aunque este procedimiento ha sido utilizado durante muchos años, el uso del formocresol en las pulpotomías sigue siendo controvertido debido a su biocompatibilidad (considerado con alto potencial carcinogénico).6

Es necesario un cemento antibacteriano que cubra la pulpa para evitar fallas en el tratamiento y la diseminación de los procesos inflamatorios e infecciosos a lo largo del canal radicular.7 Dichos materiales deben poseer biocompatibilidad y bioactividad para promover la actividad de las células madre de la pulpa dental y la curación de la pulpa en los dientes temporales (células madre de la pulpa dental inmaduras (IDPSC)).8

Entre las alternativas de tratamiento que ofrecen una actividad antibacteriana, se encuentran las pastas antibióticas. Una de ellas es la pasta CTZ (cloranfenicol, tetraciclina y óxido de zinc más eugenol); sin embargo, a pesar de ser un cemento antibiótico utilizado por más de 30 años, pocos trabajos de investigación, han sido realizados en dientes vitales, y no es claro el efecto de la pasta sobre el tejido pulpar, así como el de sus componentes de forma individual.9 También se ha utilizado una pasta Triantibiótica, que contiene ciprofloxacino, metronidazol y minociclina, utilizadas para la eliminación de microorganismos dentro del canal radicular necrótico en procedimientos regenerativos.10 Varios estudios han evaluado la citotoxicidad de los materiales para pulpotomías en células madre de pulpa dental humana a partir de dientes permanentes, pero pocos estudios han utilizado células madre de pulpa dental de dientes primarios.8

En la búsqueda de un sustituto al formocresol, se han empleado una gran variedad de materiales que obedecen a las diferentes filosofías de terapéutica pulpar, pero no se ha reportado aún el empleo de pastas antibióticas. De acuerdo con la filosofía de regeneración, se han desarrollado diversos estudios con materiales a base de silicatos teniendo un éxito aceptable; sin embargo, sería de gran utilidad poder evaluar pastas antibióticas que estén compuestas con ciprofloxacino y metronidazol, para determinar si es que existe o no viabilidad celular que pueda hacer posible el empleo de estas pastas en la terapéutica pulpar de dientes temporales, el uso de este tipo de material tendría como ventaja la desinfección de la pulpa residual a través del efecto antibacteriano, garantizando un tratamiento libre de contaminación, que es uno de los principios para el éxito del tratamiento (se aúnan un correcto diagnóstico y un buen sellado), y un costo más económico que otros productos existentes en el mercado.

El objetivo de este trabajo es evaluar la viabilidad de las células de la pulpa dental frente a diferentes concentraciones de antibióticos (ciprofloxacino y metronidazol) en un periodo de 3, 6, 9, 12 y 15 días.

Materiales y métodos

En la Clínica de Odontopediatria de la División de Estudios de Posgrado e Investigación de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional Autónoma de México, se recolectaron dientes supernumerarios bajo la autorización y firma del consentimiento válidamente informado de los padres o tutores de los pacientes sometidos a extracción. Se realizó el bloqueo anestésico con clorhidrato de lidocaína al 2%. Los dientes extraídos fueron colocados inmediatamente en una solución fría compuesta por alfa-MEM y posteriormente transportados al Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos (Figura 1).

Figura 1. Diente en solución alfa-MEM.
Figura 1. Diente en solución alfa-MEM.

Colecta del tejido pulpar

Se colectó el tejido pulpar que fue disgregado mediante la utilización de una hoja de bisturí del número 15. Los explantes se cultivaron en placas de cultivo de 6 pozos y se mantuvieron a una temperatura de 36.7°C y a una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2, en un ambiente con 100% de humedad, para esperar la proliferación celular de 5 a 7 semanas.

Sembrado celular

Una vez proliferadas las células de la pulpa dental, se lavó el medio alfa-MEM con PBS (amortiguador de fosfatos salinos), se colocaron 2 ml de tripsina 5 minutos a 37° para iniciar la activación. Pasados los 5 minutos se interrumpió la reacción de la tripsina con medio alfa-MEM. Se colocó en la centrifuga durante 5 minutos, se decantó el medio y se disgregó el pellet con 1 ml de medio usando una pipeta de 10 microlitros (Figura 2). Fue colocado en la cámara de Neubauer para iniciar el conteo celular, una vez realizado esto se colocaron 7.2 µl x 2 ml (equivalente a 10 000 células en un contendedor de 24 pozos), se incubaron de nuevo a 37° para que las células se pegaran a las cajas y trabajar al día siguiente (Figura 3).

Figura 2. Sembrado Celular.
Figura 2. Sembrado Celular.
Figura 3. Cámara de Neubauer.
Figura 3. Cámara de Neubauer.

Concentraciones Antibióticas

Se decidió trabajar con concentraciones de 0.500, 0.250 y 0.125 mg/ml de ciprofloxacino y metronidazol en la primera etapa y en la segunda etapa con concentraciones de 0.250, 0.125 mg/ml de ciprofloxacino y metronidazol y una combinación de ambos a 0.250 mg/ml cada uno. Se utilizaron antibióticos en solución inyectable para facilitar la mezcla con el medio alfa - MEM. Las concentraciones deseadas fueron obtenidas con la aplicación de la fórmula de diluciones y concentraciones, ya que las mismas debían ser adaptadas a las requeridas para el estudio. Una vez realizado esto, se colocó en los pozos correspondientes la cantidad de 300 µl de la combinación de medio y la dilución antibiótica en cada prueba (Figura 4).

Figura 4. Pruebas con concentraciones antibióticas.
Figura 4. Pruebas con concentraciones antibióticas.

Conteo celular

Una vez que las células se pegaron a las cajas, se procedió a realizar el conteo celular utilizando Cell Counting Kit–8 (CCK-8) (Figura 5), que permite ensayos colorimétricos convenientes para la determinación del número de células viables en la proliferación celular y ensayos de citotoxicidad mediante la utilización de una sal monosódica de tetrazolio altamente soluble en agua WST-8 [2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)2H- tetrazolio] que al ser reducida por las deshidrogenasas da un producto coloreado naranja de formazán que es soluble en agua, de esta manera, la cantidad de colorante generado por las deshidrogenasas es directamente proporcional al número de células vivas. Las células aisladas de la pulpa dental fueron cultivadas a una densidad de 1 x 104 células/ml por triplicado durante 3, 6 y 9 días. Después de cada de día de cultivo, las células fueron incubadas con el reactivo CCK-8 (10 µl) a 37°C por 3 horas para posteriormente ser adicionado a una placa de 96 pozos y llevado a un lector de ELISA para obtener la densidad óptica a una longitud de onda de 450 nm (absorbancia) (Figura 6). Dado que la generación del producto es directamente proporcional a la actividad de la enzima deshidrogenasa, una disminución en los valores obtenidos en la absorbancia nos indicó una medida de la citotoxicidad de los antibióticos empleados. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Figura 5. Colocación de reactivo CCK-8.
Figura 5. Colocación de reactivo CCK-8.
Figura 6. Lector de Elisa.
Figura 6. Lector de Elisa.

Análisis estadístico

Los datos de las pruebas fueron analizados mediante el software estadístico SPSS versión 24.0.0.0. Los datos se analizaron para una distribución no paramétrica utilizando la prueba de Kruskal-Wallis. Las comparaciones entre los días y los grupos, así como el conteo celular se analizaron usando la prueba de Mann-Whitney. Un valor de P ≤ 0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Primera etapa: prueba piloto

En el día 3, el crecimiento fue lento, posiblemente por el proceso de adaptación celular, que podría indicar que se sufrió un proceso de inflamación, sin embargo, en los días 6 y 9, el crecimiento celular se vio aumentado principalmente en las concentraciones de 0.250mg/1ml y 0.125mg/1ml para cada uno de los antibióticos utilizados (Gráfica 1).

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Gráfica 1. Promedios de las muestras por triplicado (grupo 1 = 0.500mg/1ml, grupo 2 = 0.250mg/1ml, grupo 3 = 0.125mg/1ml).

Segunda etapa: prueba experimental

Con base en estos resultados se procedió a realizar la prueba experimental, las concentraciones elegidas fueron para cada uno de los antibióticos 0.250mg/1ml, 0.125mg/1ml y una combinación de ambos a una dosis de 0.250mg/1ml cada uno. Para realizar esta fase de la prueba, se realizó el mismo protocolo de colecta pulpar, sembrado y conteo celular que en la prueba piloto.

Las evaluaciones del estudio se realizaron para todos los días y grupos, utilizando la prueba no paramétrica Kruskal-Wallis, un valor de P ≤ 0.05 se consideró como significativo.

Se asignaron valores para poder evaluar estas variables de la siguiente manera:

Grupo 0 = Control, Grupo 1 = Ciprofloxacino 0.250mg/1ml, Grupo 2 = Ciprofloxacino 0.125mg/ml, Grupo 3 = Metronidazol 0.250mg/1ml, Grupo 4 = Metronidazol 0.125mg/1ml, Grupo 5 = Ciprofloxacino 0.250mg/1ml + Metronidazol 0.250mg/1ml.

En el día 3 el valor de P fue de 0.046, esto se interpreta como un valor significativo. En el día 6 se obtuvo un valor de 0.009, en el día 9 resultó de 0.020. En el día 12 fue de 0.030. Y en el día 15 de 0.382, siendo este valor el único considerado como no estadísticamente significativo.

Para determinar exactamente entre qué grupos se encontraba esta diferencia se utilizó la prueba no paramétrica Mann-Whitney (2 variables independientes).

Día 3: Entre los grupos 0-1, 0-2, 0-3, 0-4 y 0-5 el valor de P fue de 0.050; entre los grupos 1-2 fue de 0.127; entre los grupos 1-3 y 1-4 fue de 0.513; entre los grupos 1-5 fue de 0.050; entre los grupos 2-3 fue de 0.275; entre los grupos 2-4 fue de 0.127; entre los grupos 2-5 fue de 0.050; entre los grupos 3-4 0.827; entre los grupos 3-5 fue de 0.275; entre los grupos 4-5 fue de 0.827.

Día 6: Entre los grupos 0-1, 0-2, 0-3, 1-4, 2-4, 0-5 y 4-5 el valor fue de 0.037; entre los grupos 0-4 fue de 0.025; entre los grupos 1-2, 2-5 y 3-5 fue de 0.050; entre los grupos 1- 3 fue de 0.275; entre los grupos 2-3 fue de 0.513; entre los grupos 3-4 fue de 0.121.

Día 9: Entre los grupos 0-1, 0-2, 1-3, 1-5, 2-3, 2-4 y 2-5 el valor de P fue de 0.050; entre los grupos 0-3, 0-4, 1-4, 3-5 y 4-5 fue de 0.127; entre los grupos 0-5 y 3-4 fue de 0.827; entre los grupos 1-2 fue de 0.513; entre los grupos 3-4 fue de 0.827.

Día 12: Entre los grupos 0-1, 0-2, 0-5, 1-2, 1-3, 1-4, 2-3 el valor de P fue de 0.050; entre los grupos 0-3, 0-4, 3-5 fue de 0.127; entre los grupos 1-5, 2-4 fue de 0.275; entre los grupos 2-5 fue de 0.827; entre los grupos 3-4 y 4-5 fue de 0.513.

Día 15: Entre los grupos 0-1, el valor de P 0.127; entre 1- 2, fue de 0.121; entre 2-3 fue de 0.178; en el grupo 3-4 fue de 0.513; entre el grupo 4-5 fue de 0.827.

Las diferencias estadísticamente significativas encontradas (en cursivas), fueron en su mayoría contra el grupo control, esto puede ser explicado porque el mismo no tenía la presencia de algún tipo de antibiótico, por lo tanto, el crecimiento celular en los primeros días iba a ser más acelerado que en los grupos que tenían alguna de las diluciones antibióticas en lo que se daba el proceso de adaptación celular, sin embargo, aunque de manera más lenta, la proliferación celular se seguía dando.

Los resultados de la prueba experimental indican que, ante las nuevas dosificaciones basadas en la prueba piloto, existe viabilidad de las células de la pulpa dental aún en presencia de las concentraciones con antibióticos combinados, siendo incluso en estas concentraciones en donde se encontró una viabilidad celular más elevada (Gráfica 2). Esto nos hace concluir que la sinergia entre estos medicamentos favorece la proliferación de las células de la pulpa, puesto que en el día 15 de la prueba, el número de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) fue el más elevado de las distintas concentraciones evaluadas.

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Gráfica 2. Promedios de las muestras por triplicado, se muestra el comportamiento del crecimiento celular.

Discusión

Una pulpotomía se realiza en un diente primario con caries extensa, pero sin evidencia de patología radicular. La pulpa coronaria es amputada, y la superficie del tejido pulpar radicular vital restante se trata con un medicamento a largo plazo (sulfato férrico, formocresol, solución de Buckley, hipoclorito de sodio, mineral trióxido agregado “MTA”, electrocirugía). (AAPD 2014)

La elección del medicamento utilizado en los procedimientos de pulpotomía está influenciada por una serie de factores que incluyen el potencial de cicatrización de la pulpa, las propiedades antibacterianas, las propiedades físicas, la biocompatibilidad, la citotoxicidad, la estabilidad dimensional, las propiedades de manipulación, etc. La prevención de la microfiltración es un factor importante que contribuye al éxito de cualquier procedimiento de terapia de pulpa vital. (Kusum B 2015)

Atendiendo a los factores de citotoxicidad, biocompatibilidad y propiedades antibacterianas, se han desarrollado varias investigaciones que involucran algún tipo de agente antimicrobiano, sin embargo, la mayoría se han enfocado a evaluar estas respuestas en dientes con tratamientos de pulpectomía o en dientes permanentes. En el caso de las pulpotomías se han utilizado más ampliamente biomateriales a base de silicatos o hidróxido de calcio. Por ejemplo, Collado M, et al., (2017) realizaron pruebas in vitro relacionadas con biocompatibilidad para proporcionar datos sobre el uso seguro de biomateriales para la terapia de pulpa vital en dientes temporales con silicato tricálcico, silicato de calcio modificado con resina y óxido de zinc con eugenol (Biodentine, MTA, TheraCal LC e IRM) para evaluar su citocompatibilidad con las células madre de dientes primarios humanos exfoliados (SHED). Los resultados mostraron que ni Biodentine ni MTA eran citotóxicos, al menos en diluciones 1: 1, 1: 2 y 1: 4. Sin embargo, en presencia de IRM y Theracal LC, la viabilidad celular era muy baja o casi inexistente.

En el año de 1981, Guedes-Pinto, Paiva y Bozzola realizaron un trabajo clínico que agrupaba 45 dientes con pulpa afectada (técnica no instrumentada), utilizaron como material obturador una pasta compuesta por yodoformo, paramonoclorofenol alcanforado y Rifocort (crema dermatológica que contiene acetato de prednisolona y rifamicina) a partes iguales. Después de un seguimiento de 1 año, hubo apenas un caso de fracaso. Por tanto, estos autores afirmaron que el material obturador presentaba una propiedad antiséptica óptima, era reabsorbible y reducía la reacción antiinflamatoria después del término del tratamiento. (Rezende L 1992)

Los antibióticos evaluados en esta investigación fueron anteriormente estudiados para procedimientos de endodoncia regenerativa en dientes permanentes por Kamoki K, et al., (2015) aunque se ha reportado un impacto considerablemente negativo sobre la supervivencia de las células madre de la pulpa dental después de la exposición a andamios que contienen ciprofloxacino y no a andamios que contienen metronidazol, ya que, el primero disminuye la viabilidad de las células, dando lugar a múltiples efectos adversos (debido a una disminución en la síntesis de proteínas codificadas en el DNA mitocondrial), es importante mencionar que los efectos citotóxicos dependen de la dosis y el tiempo de exposición. Estos autores demostraron que una concentración reducida de ciprofloxacino con incorporación de andamios basados en polidioxanona, mantienen las propiedades antimicrobianas y al mismo tiempo mejoran la viabilidad y la proliferación de las células madre de la pulpa dental. Lo anterior concuerda con los resultados de esta investigación, puesto que, la viabilidad celular de la pulpa dental es inversamente proporcional a la dosis, a menor concentración antibiótica, mayor proliferación de las células de la pulpa dental.

Por otra parte, siendo parte de la investigación clínica, Trairatvorakul C., et al., (2012) realizó un estudio en 60 casos con seguimiento de 24 a 27 meses, las tasas de éxito determinadas por la evaluación clínica y radiográfica fueron del 75% y 36.7% respectivamente, sin embargo, la tasa de éxito global del tratamiento endodóntico sin instrumentación de la pasta antibiótica 3Mix-MP (ciprofloxaxino, metronidazol y minociclina como antibióticos y macrogol y propilenglicol como vehículos) fue del 36.7% y el 15.8% de los casos mostró una respuesta de resorción interna, concluyendo que el tratamiento endodóntico sin instrumentación con 3Mix-MP mostró un buen éxito clínico, pero tuvo una tasa de éxito baja basada en la evaluación radiográfica al seguimiento de 2 años.

Sin embargo, en otro estudio realizado por Prabakar A, et al., (2008) se concluyó que el tratamiento endodóntico con una mezcla antibacteriana (ciprofloxacino, metronidazol y minociclina mezclada con propilenglicol y macrogol) en dientes primarios mostró un buen éxito clínico y radiográfico al mes, 6 meses y al año de seguimiento. Todos los casos tratados fueron clínica y radiográficamente exitosos con la eliminación del tejido necrótico coronario y acceso a la pulpa radicular en comparación con la eliminación de la pulpa solo coronal. No obstante, se abogó por más estudios clínicos e histológicos con un seguimiento más largo o hasta el período de exfoliación dental para determinar la eficacia de esta modalidad de tratamiento. En esta investigación in vitro, también sería de utilidad un periodo de observación más amplio en el que se pueda seguir evaluando la adaptación de las células expuestas a los medicamentos, ya que, se observó una mayor viabilidad a partir del día 12 de observación.

Limitaciones del estudio

Dentro de las limitaciones de este estudio, se encuentran las siguientes: pretendía evaluar la viabilidad de células pulpares de dientes temporales al estar en contacto con las diferentes concentraciones de antibióticos, sin embargo, por razones éticas el estudio se realizó con pulpas de dientes supernumerarios extraídos a pacientes pediátricos. Por otra parte, el realizar este procedimiento implicaría trabajar con pulpas infectadas por diferentes tipos de microorganismos, sería importante realizar un estudio que evalúe si las concentraciones en estas pruebas son adecuadas para la correcta desinfección del tejido pulpar remanente.

Conclusión

Con base en los resultados obtenidos, se puede concluir que existe viabilidad de las células de la pulpa dental en presencia de antibióticos (ciprofloxacino y metronidazol), sin embargo, las concentraciones de los mismos serán un factor importante a considerar para permitir que el crecimiento celular sea adecuado.

Por otra parte, sería conveniente duplicar este estudio para verificar el estado de las células, es decir, si éstas estarían consideras dentro de los parámetros de una célula sana en cuanto a su estructura. Son necesarias más investigaciones acerca del tema para que en un futuro se pueda establecer el uso seguro de esta alternativa en los tratamientos de pulpotomías en la dentición temporal.

Agradecimientos

La realización de este trabajo fue posible gracias al apoyo del Laboratorio de Bioingeniería de Tejidos de la División de Estudios de Posgrado e Investigación de la Universidad Nacional Autónoma de México bajo la dirección de Dr. Marco Antonio Álvarez Pérez y a la Dra. Ana María Wintergerts Lavín quien participó en el análisis estadístico y en la interpretación de datos.


Referencias

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